南方水产科学

作者：李敏, 李永福, 黄育浩, 陈灼均, 莫钻兰, 钟群芳, 李本旺, 张险朋

关键词：罗非鱼湖病毒, 微滴式逆转录数字PCR, 线性关系, 特异性, 变异系数

建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的罗非鱼湖病毒反转录微滴式数字PCR (RT-ddPCR) 检测方法，可为罗非鱼湖病毒的定量检测提供技术支持。参照NCBI中GenBank登陆的TiLV第3段全基因序列，选择hypothetical protein gene基因作为靶位基因设计合成了1 对引物和探针，以TiLV-cDNA为模板，摸索、优化反应方法，建立与实时荧光RT-PCR检测方法的线性关系，分析方法的敏感性、特异性、重复性，最后进行临床样品检测。结果显示，当引物、探针浓度分别为500、300 nmol·L−1且退火温度为54.2 ℃时，建立的TiLV RT-ddPCR扩增反应效率最高、阴阳性微滴分布界限最明显、平均拷贝数较高；敏感性强，检测限低至2 拷贝·μL−1，且在1~90 000 拷贝·μL−1范围内与实时荧光RT-PCR检测的线性关系较好 (R2=0.995 8)；检测变异系数低 (4.86%)；与其他5 种常见的水生动物疫病病毒 鲤浮肿病毒 (Carp edema virus, CEV)、锦鲤疱疹病毒 (Koi herpesvirus, KHV)、草鱼出血病毒 (Grass carp reovirus, GCRV)、鲫造血器官坏死病毒 (Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)、细胞肿大虹彩病毒 (Red sea bream iridovirus, RSIV) 阳性样品未发生交叉反应；在临床样品的检测中，48 份罗非鱼样品结果均为阴性，5份能力验证样品中3 份为阳性，与能力验证满意结果一致。

来源：2023年第1期

《南方水产科学》期刊编辑部

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